将近10年的时间，索拉菲尼是晚期HCC（肝细胞癌）中唯一系统治疗的选择。然而，过去几年来的快速进展导致了其他血管生成抑制剂和一些免疫检查点抑制剂(ICBs)的批准，已被添加到晚期HCC的治疗选择中。此外，贝伐珠单抗和Atezolizumab的成功结合标志着肝癌一线治疗的重要改变。近期发表在JAMAOncology（IF,24.79）上的一篇综述总结了HCC中免疫检查点抑制剂的前景和挑战，并讨论了预测治疗反应或耐药性的生物标志物的情况1。HCC是最常见的原发性肝癌，也是导致癌症相关死亡的主要原因。早期的HCC可以通过手术或消融治疗，但在晚期，可用的HCC治疗(例如，经动脉化疗栓塞，系统治疗)只是姑息性治疗.酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼(sorafenib)是第一个全身治疗晚期肝细胞癌的药物。虽然索拉非尼是十多年来唯一的系统性治疗选择，但该领域在过去四年中发展迅速。有四种药物在III期试验中获得成功并最终获得批准:用于一线治疗的lenvatinib(mTKI)，用于二线治疗的regorafenib、cabozantinib(均为mTKIs)和ramucirumab(抗血管内皮生长因子[抗vegf]受体(R)2)。另外，抗PD-1和CTLA-4的免疫检查点抑制剂在HCC的二线治疗中也被获批。在这一进展的推动下，目前有大量研究在世界范围内对ICBs进行测试，或单独测试，或与其他系统或局部疗法联合测试。在肝癌中使用免疫疗法是有理论依据的。虽然HCC可能具有免疫原性，但肿瘤细胞、浸润的间质细胞和免疫细胞促进了免疫抑制肿瘤微环境(TME)，包括上调其表面的免疫检查点分子。此外，大多数原发性肝癌患者存在耐受性肝环境，以及由潜在肝病引起的慢性炎症，进一步增强免疫抑制，使癌细胞逃避免疫监视，潜在地抵抗ICB治疗。在这篇综述中，总结了近期的临床资料并讨论生物标志物来预测免疫治疗的反应或耐药性.我们还详细阐述了促进肿瘤免疫抑制的两种途径的作用:VEGF和转化生长因子-β(TGF)-β通路。总结了抑制这些通路如何重新编辑免疫抑制TME并提高ICBs在HCC中的疗效的基本原理和初步证据。1
晚期HCC中ICB的应用
在晚期HCC中，多种ICBs无论是单药还是联合靶向治疗都已经进行了临床I,II,III期临床试验。免疫单药的有效率在15%~23%之间，联合治疗后会增至30%左右（表1,表2）.
▼表1晚期HCC免疫检查点抑制剂I/II期临床试验汇总
（只包括人数≥35人的试验；NR：未达到；ORR：根据RECIST标准）
▼表2晚期HCC免疫检查点抑制剂III期临床试验汇总
（a：主要研究终点未达到；b：达到主要研究终点）
基于Nivolumab和Pembrolizumab和Nivolumab联合ipilimumab的2期临床试验在HCC中持久抗肿瘤反应，FDA对这些ICBs给予了条件批准。
CheckMate研究包括Nivolumab单药和联合ipilimumab，单药使用下，一线未接受过索拉菲尼治疗的患者ORR达到22.5%，中位OS达到29个月。二线（一线接受过索拉菲尼治疗）的患者ORR达到18.7%，中位OS达到15个月。双药使用下（二线），ORR达到33%，中位OS达到23个月2。KEYNOTE-研究，经过索拉菲尼治疗的患者接受Pembrolizumab治疗ORR达到17%，中位OS达到13个月3。尽管从1/2期研究中得到了积极的信号，但随后的2个试验NivolumabPembrolizumab在HCC的随机3期试验均未能达到其主要终点.CheckMate研究比较了Nivolumab和索拉非尼在肝癌晚期一线患者中的作用(表2)4.未达到预设的主要终点显著性阈值(hazardratio
，0.85;P=.09)。然而，Nivolumab的中位OS明显更长(16.4个月vs14.7个月)，是任何药物单药治疗晚期HCC最长的。虽然相对较低，但所取得的ORR是索拉非尼的两倍（15%vs7%），并且有4%的患者获得了完全缓解。相较于索拉非尼，Nivolumab的安全性和生活质量也有所提高.另一项随机3期试验(KEYNOTE-)在索拉非尼治疗过的肝细胞癌患者中对比了Pembrolizumab和安慰剂，但其OS和无进展生存期(PFS)也未达到预定的显著性水平(表2)5.Pembrolizumab与安慰剂的中位OS为13.9个月vs10.6个月(HR,0.78;P=.02)，中位PFS为3.0个月vs2.8个月(HR,0.78;P=.02)。Pembrolizumab相较于安慰剂具有很好的耐受性并且能提高ORR（18.3%VS4.4%），中位持续缓解时间13.8m.尽管ICBs具有明显的活性，但两个3期试验都失败了，这可能是由于受研究后治疗(包括ICBs)的影响。另一项在亚洲患者针对先前接受索拉非尼治疗的患者对比Pembrolizumabvs安慰剂的3期试验正在进行中（KEYNOTE-）。ICB单药治疗的挫折表明，可能需要联合其他药物来提高ICB的疗效。在一项随机的3期试验中6，一线Atezolizumab(抗-PD-L1单抗)和贝伐珠单抗(抗VEGF抗体)显著改善mOSVS索拉非尼(未达到vs13.2个月;HR0.58;P.)和mPFS(6.8个月vs4.3个月;HR,0.59;P＜.)(表2).在联合用药组中，与治疗相关的3-4级不良事件较少，安全性也更好。因此，尽管取得了成功，对于HCC中最佳融合的ICBs，仍有很多问题有待了解。在联合用药研究中已经对安全性和有效性进行了研究。大型研究已经证实了在小型研究中观察到的反应的持久性，但是两个测试抗PD-1单药疗法的3期临床试验都失败了。显然，使用预测性生物标志物来选择患者是非常必要的。此外，Nivolumab与Ipilimumab、Atezolizumab与贝伐珠单抗联合使用的数据表明，联合用药是提高肝癌免疫治疗疗效的有效策略。2
疗效的潜在预测因素
尽管与靶向治疗的结合几乎使ORR翻倍，但仍然有超过一半的患者无响应。此外，在PD-1/PD-L1靶向治疗过程中，ICBs可导致严重的免疫相关不良事件以及超进展(加速肿瘤生长)(HCC发生大约占8%)7。基于生物标记进行患者选择可以帮助最大化疗效，减少可能无法从ICBs获益甚至受到伤害的患者数量。据我们所知，目前还没有预测ICB反应的生物标志物。基于HCC试验的探索终点，已经提出了几个潜在的生物标志物。这些生物标志物主要包括PD-L1表达、肿瘤突变负担和特异性基因组改变。PD-L1免疫组化的表达常用于非小细胞肺癌或胃癌的患者分层；然而，一些PD-L1阴性肿瘤患者对ICBs有反应，而PD-L1的表达与其他肿瘤类型的临床反应的相关性并不十分确凿。HCC中肿瘤PD-L1表达(cutoff≥1%)不能预测nivolumab或pembrolizumab的应答2.联合阳性评分(肿瘤和免疫细胞上的PD-L1表达)，仅在一个亚组患者中评估(n=52)，与Pembrolizumab的ORR和PFS相关3。高肿瘤突变负担(即非同义单核苷酸变异的数量)可能增加ICB反应的可能性8.此外，微卫星不稳定性高的肿瘤具有较高的肿瘤突变负担，使其更可能对ICBs敏感Pembrolizumab被FDA批准用于任何微卫星不稳定性高或错配修复缺陷肿瘤并成为第一种获批泛瘤种的Biomarker。在HCC中，肿瘤突变负担通常较低，其作为预测对ICB反应的生物标志物的效用还没有数据支持.同样，在HCC中也很少见微卫星不稳定性高的情况9。激活的WNT/β-catenin信号与HCC中的免疫排斥(冷、非T细胞炎症性肿瘤)相关，并被认为是免疫治疗耐药性的潜在生物标志物10，然而，这一观察需要前瞻性的证实。基于这些发现，基于生物标志物对ICB患者的选择可能会增加持久反应的可能性，但是，据我们所知，在HCC中没有这样的生物标志物被证实。基于目前的临床证据，一个包含多个因素(基因和微环境)的预测模型可能比单一的生物标志物更有可能估计免疫治疗的获益情况。3
癌细胞复杂的免疫逃逸过程
TME中多种免疫细胞和基质细胞直接或间接协调抗肿瘤免疫。肿瘤浸润CD4+和CD8+效应T淋巴细胞被认为介导了对ICBs的反应。这些细胞通过树突细胞的肿瘤抗原递呈在引流淋巴结中致敏。此外，自然杀伤细胞（NK）具有直接识别肿瘤细胞的能力，也有助于抗肿瘤免疫。肿瘤相关内皮细胞和异常的肿瘤血管系统阻碍免疫效应细胞的运输，同时促进免疫抑制细胞类型的招募。这些细胞类型包括调节性T细胞（Tregs）和骨髓来源的抑制细胞（MDSC）来抑制效应性T细胞增殖，和杀伤功能。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)表现出不同的表型，M1样TAMs被认为具有抗肿瘤活性，而M2样的TAMs具有免疫抑制和肿瘤促进作用。肿瘤相关的成纤维细胞通过抑制T细胞功能和分泌细胞外基质（T细胞浸润的物理屏障）来实现免疫抑制作用。在本研究中，我们重点研究了HCC特有的两种免疫抑制通路——VEGF和TGF-β信号通路，并通过调节几种TME细胞类型来作为重编程HCCTME和增强ICB疗效的靶点。4
VEGF通路
肝细胞癌是一种高度血管化的肿瘤，它利用新血管的活跃形成(血管生成)来生长和播散。VEGF通路是肿瘤血管生成的关键调节因子，在大多数癌症类型中上调。除了广泛研究其促进血管生成的作用外，VEGF可以直接影响骨髓系和淋巴系的细胞，并促进不同类型肿瘤的免疫逃避11。（图1）
▼图1A：VEGF靶向治疗可以逆转VEGF的免疫抑制作用
［VEGF抑制作用：包括抑制树突状细胞(DC)功能和成熟，损伤CD8+T细胞的功能和浸润，上调免疫检查点分子，以及积累免疫抑制细胞类型，包括肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)、骨髓来源的抑制细胞(MDSC)和调节性T细胞(Treg)］
▼图1B：抗VEGF治疗的效果是剂量依赖性的
（高剂量VEGF抑制剂会导致血管萎缩，从而加重肿瘤缺氧和酸中毒，支持肿瘤免疫逃避。相比之下，低剂量抗VEGF治疗可使异常和功能失调的肿瘤血管系统正常化，从而改善肿瘤灌注，缓解肿瘤缺氧，重新编辑免疫抑制环境)例如，VEGF可以损害树突状细胞的成熟和功能，树突状细胞是关键的抗原呈递细胞，并促进调节性T细胞和骨髓来源的抑制细胞的积累。VEGF还能直接和间接抑制细胞毒T淋巴细胞的浸润和功能，增加瘤内CD8+T细胞上PD-1的表达。血管内皮生长因子通过增加血管通透性(通透性)间接影响免疫，这是肿瘤血管系统异常的一个主要特征。渗漏损害肿瘤的血流，增加组织间液体压力从而导致缺氧和酸中毒，进而通过损害抗原提呈细胞和细胞毒性T淋巴细胞的功能促进免疫抑制，也会增加免疫抑制细胞的积累和免疫检查点的表达。VEGF的抑制也被证明不仅会影响血管系统，还会影响肝癌的免疫TME，但结果并不一致。一些临床前研究表明，30mg/kg/d索拉非尼治疗可减少皮下和原位小鼠肝癌模型中调节T细胞和骨髓来源抑制细胞的瘤内积累12。另一项研究表明，索拉非尼10-90mg/kg/d，通过诱导促炎因子激活介导免疫原性细胞死亡触发了自然杀伤细胞对HCC的反应13。另一方面，抗VEGF治疗引起的过度的血管修剪会增加肿瘤缺氧，并通过促进免疫抑制来抵消这些影响。此外，抗血管作用可能会影响药物向肿瘤的传递因此可能降低抗VEGF抑制剂本身或伴随ICBs的疗效。在HCC的实验模型中，40-50mg/kg的索拉非尼治疗强化了肿瘤的缺氧，增加了免疫抑制细胞类型(如骨髓来源的抑制细胞、调节细胞和M2样巨噬细胞)的积累和PD-L1的表达14。适当剂量的抗VEGF药物使功能失调的肿瘤血管正常化而不是引起过度的血管修剪可改善肿瘤灌注，缓解肿瘤缺氧，并增加伴随全身治疗(如免疫治疗)的提供。免疫点抑制剂本身可通过CD4+和CD8+淋巴细胞诱导免疫应答，使血管结构和功能正常化。此外，在临床前15和临床研究中16，低剂量抗VEGF治疗与免疫治疗联合使用显示出疗效.在小鼠乳腺癌模型中，低剂量的抗VEGFR2治疗可诱导血管正常化，从而减轻肿瘤缺氧，重编程免疫抑制TME，增强免疫治疗的效果.最近一项1b期试验报告了80mg/d(标准剂量的一半)regorafenib联合nivolumab(＞35%ORR)治疗进展期胃癌或结直肠癌的令人鼓舞的疗效数据16。一项类似的试验正在HCC中进行，使用80mg/kg/d的regorafenib和抗PD1抗体。临床前研究为这种治疗相互作用在小鼠肝癌模型中的效果提供了一些见解。一项研究表明，双重抑制VEGFR2和PD-1可导致CD4+T细胞介导的血管形成正常化，并伴有增强的抗肿瘤免疫应答和提高其疗效，包括在耐ICB的HCC模型中17。另一项研究表明，在HCC小鼠皮下模型中，lenvatinib降低了单核细胞和巨噬细胞的浸润，增加了CD8+T细胞，增强了抗PD-1治疗的抗肿瘤效果，但索拉非尼没有18。在HCC中，一些临床试验正在研究抗VEGF联合ICBs治疗(表3).根据初步数据，lenvatinib联合Pembrolizumab以及Bevacizumab联合Atezolizumab都被美FDA批准用于晚期HCC的突破性方案（表1）。在最近报道的IMbrave期3期研究中，Bevacizumab联合Atezolizumab相较于索拉非尼用于一线，无论PFS还是OS均得到显著提高，目前正在另一项3期研究中进行研究，作为切除或局部消融后的辅助治疗(IMbrave)。Lenvatinib和pembrolizumab目前正在进行3期一线试验，数据即将公布。综上所述，使用抗VEGF/VEGFR的药物来调整肿瘤免疫微环境已经证实在HCC中的临床作用，其临床效果与药剂的种类和剂量相关。新出现的临床数据支持使用更低的、血管正常化剂量的抗VEGF疗法，但还需要在更大规模的HCC研究中进一步证实。尽管机制如此复杂，但考虑到联合抗VEGF和ICB治疗是HCC治疗的新标准，未来的治疗方法将以这种新的治疗方式为基础进行改进。5
TGF-β信号通路
TGF-β通路在肝组织中具有复杂的功能，调节体内稳态。TGF-β通路异常参与了多种肝脏疾病的发病机制，包括肝细胞癌的发展。此外，TGF-β在肿瘤发生中具有双重作用，一方面作为肿瘤的抑制因子，尤其是在肿瘤早期，但在晚期的肿瘤中也能促进肿瘤进展和扩散。TME的一些成分，包括成纤维细胞、免疫细胞和细胞外基质成分，介导了这些相关的功能。TGF-β也可以调控肿瘤的免疫逃避，特别是在肿瘤晚期。其免疫抑制的功能是通过抑制T-细胞的反应来介导的，但是TGF-β还可以影响其他的免疫细胞。如TGF-β能抑制自然杀伤细胞功能并增加调节T细胞数量。TGF-β的另外一个作用就是通过上调PD-1的表达促使抗原特异性T细胞耗竭。此外也会影响诱导使肿瘤相关巨噬细胞向M2型（促肿瘤）转换。TGF-β诱导TME不同类型细胞中VEGF的表达，包括免疫细胞、肿瘤细胞和基质细胞。TGF-β和VEGF之间的crosstalk能更加刺激TGF-β介导的免疫抑制。此外，TGF-β的促纤维化作用可间接促进免疫抑制。TGF-β激活肌成纤维细胞，上调细胞外基质蛋白在肿瘤中的沉积，可能起到物理屏障的作用，导致效应T细胞被排斥（图2）。
▼图2A：血管紧张素II（AngII）激活成纤维细胞的信号通路促进细胞外基质（ECM）的沉积。
ECM作为一个物理屏障阻碍T细胞的浸润，进而妨碍免疫反应。ECM还会导致血管压力的上升，损害肿瘤灌注，加重肿瘤缺氧和酸中毒。这种缺氧和酸性的环境进而促进免疫抑制的机制。（CAF,肿瘤相关成纤维细胞）
▼图2B：血管紧张素II（AngII）还能诱导肿瘤细胞和基质细胞分泌不同的细胞因子和生长因子。
这些细胞因子抑制树突状细胞(DC)、自然杀伤细胞(NK)和T细胞的功能和积累，促进免疫抑制细胞类型的积累，包括调节性T细胞(Treg)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、中性粒细胞(TAN)和骨髓源性抑制细胞(MDSC)。最后，AngII介导的血管内皮生长因子(VEGF)上调会进一步加剧肿瘤缺氧，增加血管通透性，损害肿瘤血液灌注。TGF-β信号通路的激活与HCC中免疫耗竭类型（大约占比10%）相关，其特点为，耗竭型T细胞、M2型巨噬细胞的聚集并且上调免疫抑制相关的细胞因子.此外，最近使用TCGA转录组测序数据库描述了4个不同的TGF-β干扰水平的簇，高度激活的TGF-β簇与衰竭的免疫亚类重叠10,19。TGF-β信号通路干扰水平最低（表达水平）的患者相较于TGF-β信号通路激活的患者有更好的生存预后。这些数据提示TGF-β在免疫治疗耐药中的作用。一项2期的临床试验报道，治疗前血浆中高水平的TGF-β水平与HCC患者对Pembrolizumab耐药相关20。这些数据提示了TGF-β抑制剂能够对TME重编程并且能够提高ICB的疗效，尤其是在晚期HCC中TGF-β信号通路激活的情况。在临床前(非肝细胞癌)肿瘤模型中，阻断TGF-β可减少调节性T细胞和髓系来源的抑制细胞的浸润，促进T细胞浸润，增强抗PD-L1和抗CTLA4的治疗效果21。一项2期研究表明，在晚期HCC中，TGF-β受体1激酶抑制剂Galunisertib单独使用22或联合索拉非尼23，安全性可接受，生存期延长，尤其是在外周TGF-β减少的患者中。Galunisertib联合Nivolumab作为二线治疗方案目前正在2期临床研究中。除此之外，一项1期临床研究探讨NIS（抗TGF-β抗体）联合spartalizumab（抗PD1抗体）在晚期肿瘤中的效果，包括HCC患者24。除了直接靶向TGF-β，使用血管紧张素II（AngII）/AngIII型受体（AT1R）抑制剂也能下调TGF-β活性25，降低TGF-β的表达，封闭AngII/AT1R信号也能够阻止血管紧张素系统其他免疫抑制的作用（图2）。在几个临床前肿瘤模型中，抑制AT1R使间质纤维化正常化，从而降低实体应力，从而改善血管灌注，减少缺氧。抑制AT1R还可以减少肥胖小鼠胰腺肿瘤中肿瘤相关中性粒细胞和调节性T细胞的浸润，增加CD8+T细胞的浸润。胰腺癌患者中，基因表达谱显示使用赖诺普利（一种降压药）的患者Wnt信号通路激活减少26。这些数据表明，抑制肾素血管紧张素系统可能有增强ICB疗效的潜力，并可能有助于克服免疫治疗的原发耐药性，这可能与HCC中活化的Wnt/β-catenin信号转导有关。在乳腺癌和胰腺癌的临床前模型中，AngII/AT1R封锁重新编程了免疫抑制TME，提高了针对PD-1和CTLA-4的ICBs的疗效。一项2期的研究正在探讨AT1R抑制剂Iosartan联合Nivolumab联合放化疗在胰腺癌中的作用27。在HCC中，临床前研究显示血管紧张素系统抑制剂的应用减弱肿瘤的生长28，并且与晚期HCC患者接受索拉非尼治疗的预后改善有关。总之，TGF-β信号通路在HCC中会上调且参与抑制效应T细胞功能与免疫抑制TME相关。TGF-β促纤维化的作用能够抑制免疫细胞的浸润进而促进免疫抑制。TGF-β抑制剂（或者血管紧张素系统抑制剂）联合ICBs目前在早期临床研究中被探讨。这些方法是否能有效地重新编程HCC的免疫抑制TME还需要前瞻性的证实。6
总结和展望
免疫检查点阻断剂单药治疗Nivolumab和Pembrolizumab在HCC的随机3期临床试验中并没有显示出显著的疗效。近期，双VEGF/PD-L1阻断在一线治疗(IMbrave研究)的成功证实了联合治疗可以安全实现肝癌免疫治疗效果的假设。这一突破标志着晚期HCC标准治疗的一个重要改变。此外，该疗法的成功将直接影响到目前批准的靶向疗法在一线和二线治疗中的未来应用。这种新的一线治疗也将影响正在进行的临床研究以及晚期HCC未来试验的设计，可能还会影响免疫治疗与其他治疗方式(如手术、放疗和经动脉化疗栓塞)在疾病早期的实施。面临的挑战是应对治疗耐药性。尽管双重VEGF/PD-L1阻断使应答率提高了一倍，但仍有超过三分之二的患者没有应答。这些患者中靶向其他途径，如，TGF-β或者AT1R是否有效还有待论证。评估免疫治疗的反应或耐药性的仍然是一个挑战。生物标记的识别将有助于改善患者的预后，减少这些治疗的不良影响和经济负担。目前，还没有临床可用的生物标志物来评估对ICBs的反应。在HCC临床试验中，肿瘤组织应常规收集以更好地鉴定TME并识别潜在的生物标记物。HCC的潜在病因可能也对ICB的反应有影响。病毒性肝炎患者的慢性炎症可诱导免疫检查点分子的表达，促进效应T细胞的衰竭。3期临床试验结果表明，ICBs对潜在病毒性疾病患者的疗效优于其他病因，包括非酒精性脂肪肝。在临床前模型中，非酒精性脂肪肝损害免疫治疗的疗效。考虑到非酒精性脂肪肝相关的HCC患者激增，以及病毒相关疾病的减少，这些观察结果值得进一步研究肝细胞癌的免疫细胞景观，以确定其病因。尽管存在这些挑战，但在过去的3到4年里，随着多种抗血管生成药物和免疫疗法的发展，肝癌的全身治疗已经迅速改变，这提高了人们对这种侵袭性癌症前所未有的持久反应和生存率的期望。参考文献
1.MatthiasPinter,RakeshK.Jain,etal.TheCurrentLandscapeofImmuneCheckpointBlockadeinHepatocellularCarcinoma.JAMAOncology.Oct22.doi:10.1/jamaoncol...
2.El-KhoueiryAB,SangroB,YauT,etal.Nivolumabinpatientswithadvancedhepatocellularcarcinoma(CheckMate):anopen-label,non-
