肺癌已经成为世界上患病率第一的肿瘤。区分非小细胞肺癌中的肺腺癌与肺鳞癌，直接影响化疗方案和靶向治疗的选择。有效鉴别诊断肺腺癌和肺鳞癌是肺癌治疗用药选择的重要依据之一。
在病理标本中，当肿瘤表现出清晰腺体形态、粘液、鳞状细胞特征等形态学信息时，可以明确区分肺腺癌和肺鳞癌。然而很多低分化非小细胞肺癌，尤其是那些组织样本较小或者活检样本取材来源的组织，则需要辅助诊断协助区分。
临床上，NapsinA和TTF1（thyroidtranscriptionfactor1）免疫组化检测法在75%和80%的原发肺腺癌中表达呈阳性。这两个标记物在鉴别肺腺癌与肺鳞癌，以及鉴别原发性肺腺癌与转移瘤时，起到了关键的作用。尽管如此，仍然有约20~25%的原发性肺腺癌内无法通过免疫组化检测法检测，急需更有效的手段来检测NapsinA和TTF-1的表达情况。
基于以上原因，美国Pennsylvania盖辛格医疗中心的研究者联合RNAscope技术的开发者针对NapsinA以及TTF-1在RNA水平的原位检测进行了探究，并对比免疫组化法检出的结果，评估RNAscope法在病人石蜡样本切片中鉴别诊断原发性肺腺癌的应用前景。该研究发表在《ArchPatholLabMed》上，下文我们一起来进行实验结果解读。
◆实验过程◆
这项研究选用了80例肺腺癌，80例肺鳞癌和例非肺来源的腺癌（其中乳腺腺癌48例，卵巢腺癌42例，膀胱腺癌40例，食管和胰腺腺癌分别48、42例）。所有癌种的石蜡样本均来自~年间送往该诊疗中心的病人样本。
所有这些样本被制备成几组组织芯片（TMA）用以进行检测。在所选的80例肺腺癌中，约有95%（76例）为中度分化的肺腺癌，4例为低度分化的肺腺癌。80例鳞状细胞癌为高度到中度分化的鳞癌状态。
在进行免疫组化检测时，通过使用VentanaUltra自动化平台对80例肺腺癌和80例肺鳞癌进行了检测。检测结果中，细胞浆中的NapsinA以及细胞核内的TTF-1着色被认为是阳性结果。两位病理学家对结果进行独立评分，肿瘤细胞染色阳性5%为阴性结果，5~25%评分为1，26~50%评分为2，51~75%评分为3，75%评分为4。
在进行RNA原位杂交检测时，美国ACD公司的RNAscope2.5HDBrown试剂盒检测了80例肺腺癌，80例肺鳞癌以及例非呼吸系统来源的腺癌样本。针对NapsinA和TTF-1基因的RNA转录通过Hs-NAPSA以及Hs-NKX2-1_O1两个探针进行分别检测。与此同时Hs-PPIB以及DapB作为阳性和阴性探针，用于样本的质控检测。
RNAscope结果在普通显微镜下观察后，使用说明书推荐的评分方式：
0分（每个肿瘤细胞上有0~1个信号点或者小于50%的肿瘤细胞内2~3个信号点/肿瘤细胞）；
1分（50%的肿瘤细胞有阳性信号，每个肿瘤细胞上有2~3个信号点）；
2分（每个肿瘤细胞上有4~10个信号点），
3分（50%的肿瘤细胞内有每个细胞多于10个信号点）；
4分（50%的肿瘤细胞内有每个细胞多于10个信号点，同时50%的肿瘤细胞伴有成簇信号堆积）。
RNAscope结果由两位临床病理专家毒理对接过进行评判。两位的评判结果汇总后未出现明显不一致的结果。在对结果的评估对比中，RNAscope和IHC对于肺腺癌的评判结果见表1。
表1，对比RNAscope法与IHC法在肺腺癌石蜡切片中检测TTF-1以及NapsinA的表达及评分
在对TTF-1的RNAscope检测中，80例肺腺癌中有74例检测到TTF-1mRNA，其中有42例评分为3~4分；与之对比，免疫组化法（IHC）在80例样本中检测到66例阳性TTF-1蛋白。
RNAscope检测到的6例阴性样本在IHC法检测中也为阴性。IHC检测阴性而RNAscope检测阳性的样本中，有四例评分为1，四例评分为2。图1为RNAscope法检测TTF-1评分分别为0~4分的例图。图2为IHC法TTF-1结果为阴性（B和D）而RNAscope检测为阳性（A和C）的例图。
图1，RNAscope检测肺腺癌中TTF-1评分为0（1A），1（1B），2（1C），3（1D）和4（1E和F）分的例图。
图2，RNAscope检测肺腺癌中TTF-1评分为2（2A和C箭头所示为阳性信号）而免疫组化TTF-1为阴性（2B和D）的例图。
在对NapsinA的RNAscope检测中，80例肺腺癌中有72例检测到NapsinAmRNA，阳性检出率为90%。共有59例评分为3~4分。IHC法在80例肺腺癌中检测到62例阳性NapsinA，阳性检测率为77.5%。
RNAscope检测结果为阴性的8例样本IHC法也为阴性。其余8例IHC阴性而RNAscope阳性的病理，其中1例评分为3，2例评分为2，7例评分为1。图3为RNAscope法检测NapsinA评分分别为0~4分的例图。图4为IHC法NapsinA结果为阴性（B和D）而RNAscope检测为阳性（A和C）的例图。
图3，RNAscope检测肺腺癌中NapsinA评分为0（3A），1（3B），2（3C），3（3D）和4（3E和F）分的例图。
图4，RNAscope检测肺腺癌中NapsinA评分为3（4A）而免疫组化NapsinA为阴性（4B）和RNAscope检测肺腺癌中NapsinA评分为2（4C）而免疫组化NapsinA为阴性（4D）的例图。
在对病例中4例低分化肺腺癌的检测中，免疫组化法检测NapsinA的结果均为阴性，而RNAscope法检测到的NapsinA在这四例中有三例为阳性，其中两例评分为1，一例评分为3。相似的结果在TTF-1中也有发现（见表2）。
表2，对比RNAscope法和免疫组化法（IHC）在四例低分化肺腺癌中检测NapsinA和TTF-1的结果
在对80例肺鳞癌的检测中，RNAscope法与IHC法检测NapsinA的结果均为阴性（见表3）。
表3，对比RNAscope法与IHC法在肺鳞癌石蜡切片中检测TTF-1以及NapsinA的表达及评分
对例非肺脏来源腺癌的检测中，RNAscope检测到的TTF-1结果均为阴性，而NapsinA在1例膀胱癌，4例食管癌，2例卵巢癌中有阳性信号，其余均为阴性（见表4），免疫组化法未对这例病例进行检测。
表4，RNAscop法在例肺呼吸系统肿瘤中检测TTF-1以及NapsinA的表达
综上所述，该研究结果提示在临床上1）对于IHC法检测TTF-1和NapsinA双阴的非小细胞肺癌病例，或者2）CK7+但是IHC法检测TTF-1和NapsinA双阴的疑似肺来源的临床未知来源肿瘤，可使用RNAscope法检测NapsinA和TTF-1帮助鉴别诊断肺腺癌。
◆技术优势◆RNAscope技术是由Bio-Techne旗下AdvancedCellDiagnostics（ACD）公司研发的RNA原位杂交产品，在近年来的生物检测领域发展迅速。
与传统的RNA原位杂交相比，RNAscope技术属于新一代RNA原位杂交技术，其特异性的双Z探针设计避免了传统长链RNA探针的弊端，配以自身级联放大检测原理，可以高效敏感地检测到目标RNA。该方法的具体优势如下：
①应用广泛:使用RNAscope技术，靶点RNA为大于等于个碱基的特异序列，即可进行探针设计。因而RNAscope技术可以应用于几乎所有物种，所有组织以及所有基因的检测。
②特异性强：RNAscope独特的双Z（ZZ）探针设计有效的防止了探针的非特异性结合，同时降低了背景干扰。由于结合在非特异性位点的单个的Z探针不会产生完整的信号放大分子结合位点，并会在杂交过程中被洗脱掉，从而防止非特异性信号的放大，使得探针的信号具有高度特异性。探针设计合成需要2～4周时间即可完成。
③灵敏度高：RNAscope方法检测每个RNA分子时，只需三对双Z（ZZ）探针即可完成杂交和信号的可视化。
④单分子可视化和单细胞定量：使用RNAscope技术杂交上三对及以上双Z探针即可在标准的显微镜下呈现可观察到的点状信号。ACD公司提供的分析软件更可以定量每一个单细胞内RNA的表达水平。
⑤兼容降解的RNA：由于RNAscope三对双Z探针即可检测到目标RNA，而通常针对靶点RNA设计的探针为20对双Z探针，因而即使目标RNA发生部分降解，仍可以稳定有效地检测到靶点RNA。
⑥检测结果稳定一致性：RNAscope技术用到的探针以及所有检测试剂全部由工业化合成，且该技术针对不同样本类型（冰冻切片，石蜡切片，悬浮细胞，贴壁细胞等）已经有成熟的实验操作流程，故使得RNAscope技术检测结果具有稳定性和一致性。除了可以在实验室进行手工操作外，该产品也可以在Leica以及罗氏Ventana自动平台上运行，为结果的一致性和稳定性提供了可靠的依据。
⑦多通道多靶点同时检测：由于RNAscope技术可以同时进行多通道探针杂交以及信号放大，故在可见光检测中可以在同一张切片上同时检测两个靶点；而在荧光检测过程中，可以在同一张切片上检测三个或三个以上靶点RNA。
◆Basescope技术介绍◆
Basescope技术是由美国Bio-Techne旗下AdvancedCellDiagnostics（ACD）公司研发的RNA原位杂交产品，Basescope属于ACD公司RNAscope技术基础上的新一代产品。
与传统的RNA原位杂交相比，RNAscope技术与Basescope技术因其特异性的双Z探针设计，避免了传统长链RNA探针的弊端，配以自身级联放大检测原理，可以高效敏感地检测到目标RNA，且不需要像传统原位杂交那样要求RNasefree的环境。RNAscope技术可以在高度敏感地原位检测大于bp的RNA，而Basecope则可以实现RNAscope检测范围以外的更短序列的检测。
Basescopeassay主要应用于检测短序列的RNA目标（50-bp）：例如本文中提到的pre-miRNA；高度同源性序列；RNA点突变：例如EGFRTM、BRAFVE、KRASG12D、PIK3CAHR等；外显子跳跃：例如检测非小细胞肺癌中的METD14，环状RNA以及基因融合。
Reference：
1.ArchPatholLabMed.Apr;(4):-40.doi:10./arpa.--OA.
文章来源：ACD
预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇