将治疗性分子靶向性的递送到癌细胞中被认为是一种有前景的癌症治疗策略。抗体偶联药物（ADC，单克隆抗体通过化学连接子与生物活性药物结合）已成为一类有前景的抗癌治疗剂，是癌症治疗发展最快的领域之一。早期ADC药物研发的失败促使研究人员探索开发更有效的和性质改进的ADC药物，具有更低水平未偶联抗体、更稳定的连接子，更好的药代动力学特性、治疗指数和安全性。这些改进促进了美国食品和药物管理局批准brentuxi单克隆抗体vedotin，trastuzu单克隆抗体emtansine，以及最近的inotuzu单克隆抗体ozogamicin。此外，近期的临床研究结果激发了对ADC药物研发更高的兴趣，也导致处于临床开发中ADC数量急剧增加。本综述探讨了抗体偶联药物（ADC）的主要特征，最新研究进展，并讨论了最合适的靶抗原，单克隆抗体，细胞*药物，连接子和偶联化学的选择策略。
1.引言一个多世纪前，德国医生和科学家PaulEhrlich提出了抗体作为选择性靶向恶性细胞的“魔法子弹”的概念。尽管如此，完全实现抗体的治疗潜力还是花了大约一百年的时间。Kohler和Milstein于年引入了杂交瘤技术，使得生产治疗性单克隆抗体成为可能。然而，这种单克隆抗体由于来源于小鼠，在人体中会产生免疫原性。重组DNA技术的出现使科学家能够生产工程化抗体，包括嵌合、人源化及全人源单克隆抗体（图1）。此后，多个针对肿瘤抗原的单克隆抗体被开发出来作为传统癌症化疗的替代方案。然而，大多数单克隆抗体单药治疗对癌症的治疗作用有限，因此通常与化疗联合使用。在过去的几年里，人们一直致力于通过对单克隆抗体进行各种修饰来改善其治疗活性。
图1鼠源，嵌合，人源化和完全人单克隆抗体（单克隆抗体）的示意图。
一种很有前景的方法是将单克隆抗体和细胞*性药物结合在一起，成为一个单分子实体，称为抗体药物偶联物（ADC）。ADC是一类新兴的抗癌药物，它将单克隆抗体的靶向性与小分子*素的杀伤活性结合在一起，能够通过抗体-抗原相互作用增强肿瘤细胞中的特定药物传递，同时避免健康组织和/或细胞受到化疗损伤。图2显示了ADC的三个组成部分，包括肿瘤特异性单克隆抗体、有效的细胞*素和稳定的连接子。这种三联分子作为一种强大的肿瘤杀伤药物，能够将高细胞*性的小分子（也称为有效载荷或弹头）直接输送到癌细胞。
图2抗体药物偶联物（ADC）的示意图。
尽管ADC的概念非常简单，但到目前为止，经过大约30多年的研究，只有三种药物获得批准上市，brentuxi单克隆抗体vedotin(Adcetris?,SeattleGenetics)于年,trastuzu单克隆抗体emtansine(Kadcyla?Roche)于年,以及最近inotuzu单克隆抗体ozogamicinal(Besponsa?;Pfizer)于年，分别用于治疗霍奇金淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤（靶向CD30），转移性乳腺癌（靶向HER2）和B细胞前体急性淋巴细胞白血病（靶向CD22）。正如临床试验阶段结束后的ADC药物的数量所示，ADC令人满意的疗效比先前预期的更难实现，这突出了ADC开发的难度。本综述详细综述了ADC当前发展状况和前景展望；同时也讨论了ADC药物开发时，抗原靶点、有效载荷和连接子的选择所面临的挑战和潜在解决方案；以及针对特定位点偶联的单克隆抗体的选择和优化。
2.ADC的历史癌症的药物治疗可追溯到20世纪中期，人们发现氮芥通过靶向快速分裂的癌细胞来破坏个体的骨髓和淋巴组织。此类化疗药物包括叶酸和嘌呤类似物（甲氨蝶呤和6-巯基嘌呤）、微管聚合抑制剂/促进剂（长春花碱和紫杉烷）和DNA破坏剂（蒽环类和氮芥）。这种化合物既作用于癌细胞，也作用于其他分裂细胞，因此接受治疗的患者会经历严重的副作用，大大限制了可使用的剂量。这些药物的治疗指数（最大耐受剂量/最小有效剂量）很小，导致治疗窗口狭窄。为了解决上述问题，人们做了许多尝试。ADC药物的前景就在于它能够将有*化合物选择性地递送至癌细胞。
2.1第一代ADC
在第一代ADC药物中，抗癌药物如丝裂霉素C、伊达霉素、蒽环素、N-乙酰麦法伦，阿霉素，长春花碱和甲氨蝶呤，主要通过不可降解的连接子与小鼠单克隆抗体结合。KS1/4-甲氨蝶呤和BR96-阿霉素是第一代ADC的代表；前者由鼠源单克隆抗体KS1/4通过酰胺键与甲氨蝶呤结合，用于治疗非小细胞肺癌，后者由一个嵌合的单克隆抗体BR96通过一个酸不稳定的腙键与阿霉素结合，用于治疗转移性乳腺癌。然而，对第一代ADC的体外和体内评价结果表明，这些ADC药物仅具有中等效能，而且往往比母体药物更低的活性。第一代ADC药物失败的原因可能有以下几点：
药物效力：患者血液循环中的药物浓度不在治疗范围内。
靶点抗原表达：由于肿瘤细胞仅表达少量抗原分子（稍后讨论），细胞内ADC递送的药物分子数量低于杀死细胞所需的阈值浓度。
ADC内化：进入细胞的实际ADC分子数量低于与细胞表面结合的分子数量。
肿瘤定位：患者肿瘤处放射性标记单克隆抗体的定位率较低（注射剂量/g肿瘤的～0.–0.08%）。相比之下，小鼠异种移植肿瘤的累积率更高（注射剂量/g肿瘤的～15-20%）。
连接子稳定性：使用的连接子太稳定（导致低效和无效）或太不稳定（导致靶点特异性差和系统*性高）。腙键的短半衰期（43小时）导致了由于过早的药物释放而引起的*性。
免疫反应：早期ADC中使用的单克隆抗体是鼠源或嵌合体，导致免疫反应和人抗鼠抗体（HAMAs）的产生。
这些初步结果明确了第一代ADC中的关键问题。然而，Wyeth和Celltech通过开发Gemtuzu单克隆抗体-Ozogamicin（Mylotarg?，辉瑞）改善了第一代ADC药物，它是由一种高活性的calicheamicin衍生物和一种低免疫原性的抗CD33人源化单克隆抗体结合而成。尽管其在临床上表现出了良好的活性，并于年获得FDA的批准，但随后的临床数据引发了对安全性和临床结果的担忧后，Gemtuzu单克隆抗体Ozogamicin随后退出了市场。Gemtuzu单克隆抗体-Ozogamicin存在几个潜在的缺点，包括连接子缺乏稳定性（48小时释放50%的结合药物）、使用的calicheamicin具有高疏水性、存在50%的未结合单克隆抗体、差的CMC特性以及高*性。此外，细胞通过外排泵、多药耐药蛋白1（MDR1）和多药耐药相关蛋白1（MRP1）从细胞中清除了Gemtuzu单克隆抗体-Ozogamicin。
2.2第二代ADC
从第一代ADC中汲取的经验教训促使了第二代ADC的发展。有以下几个原因：在过去的15年里，单克隆抗体技术不断改进；单克隆抗体对肿瘤细胞的选择性越来越高，与正常细胞的交叉反应越来越少。更重要的是，早期使用抗癌药物作为有效载荷的ADC缺乏临床成功，促进了更高活性分子（-0倍）的出现。与第一代ADC相比，第二代ADC具有更好的CMC特性。FDA批准的三种ADC药物：Brentuxi单克隆抗体vedotin、ado-trastuzu单克隆抗体emtansine和Inotuzu单克隆抗体ozogamicin，反映出了第二代ADC药物的研发成就，显示出令人印象深刻的临床疗效和安全性。
然而，由于脱靶*性、与未结合抗体的竞争以及药物抗体比（DAR）为8引起的ADC聚集或快速清除等原因，目前大多数第二代ADC显示出较窄的治疗窗口。第二代ADC有着不同的DAR值分布（DAR=0-8），平均DAR为3.5（例如，trastuzu单克隆抗体emtansine）或4（例如，brentuxi单克隆抗体vedotin）。大约有5%的未结合抗体与ADC竞争结合抗原，尽管这对Brentuxi单克隆抗体vedotin和trastuzu单克隆抗体emtansine（含有5%的未结合物种）似乎没有问题，但对于50%未结合抗体的gemtuzu单克隆抗体ozogamicin来说，未结合抗体的存在，问题更为明显。此外，DAR4的ADC被证明具有较低的耐受性、较高的血浆清除率和较低的体内疗效。
2.3第三代ADC
在过去的十年中，第一代和第二代ADC的经验教训现在被用于第三代ADCs的开发。单克隆抗体的优化、连接子和偶联工艺的优化可以提高第三代ADC的治疗指数。位点特异性偶联被认为是ADC成功开发的关键，保证了确定的DAR值及ADC的均一性。MEDI（抗HER2双表位单克隆抗体（靶向同一靶标上的两个不同的非重叠表位）通过马来酰亚胺与四个微管抑制剂偶联）、vadastuxi单克隆抗体taliline（抗CD33单克隆抗体与PBD二聚体通过酶可裂解的连接子偶联）和IMGN（抗CD33单克隆抗体与三个吲哚并苯并二氮通过可裂解的二硫键连接子偶联）分别代表了第三代ADC产品。
第三代ADC利用小分子药物与工程单克隆抗体的位点特异性结合，产生的ADC的DARs为2或4，这种ADC药物没有增加的全身*性，无未结合的单克隆抗体，稳定性和药代动力学得到改善，具有更低的偶联脱落速度，更高的药物活性以及低抗原水平下的高细胞活性。
3.ADC的关键要素ADC的成功取决于四个因素：（a）靶抗原，（b）抗体特性，（c）小分子药物活性和（d）偶联策略。
3.1靶点选择
ADC的成功开发依赖于选择合适的靶点抗原，ADC的单克隆抗体部分可以与之结合。因为细胞表面抗原靶标的数量有限，而抗原-抗体复合物的内化过程通常效率低下，所以，抗原的选择具有一定挑战性。靶点抗原选择需要考虑几个因素：为了减少脱靶*性，为ADC提供可接受的治疗指数，靶抗原应在肿瘤中的表达水平较高，在正常组织中的表达很少或不表达，或仅在特定组织类型中有表达。然而，在肿瘤细胞表面很少有完全特异性抗原（肿瘤特异性抗原），大多数ADC靶点往往是肿瘤相关抗原。值得注意的是，除非这些细胞对药物作用不敏感，否则正常细胞上此类抗原的表达应保持在最低水平。正常细胞中靶点抗原的表达会导致靶外ADC的摄取，进而产生*性并降低了肿瘤治疗的ADC使用剂量。目前在临床试验研究中发现了一些有希望的抗原，这些抗原在一种或几种实体瘤的相对特异性表达，包括CD（在多发性骨髓瘤和多种实体瘤中表达）、5T4（在大多数实体瘤的细胞表面表达）和间皮素（在胰腺癌和卵巢癌中表达）。重要的是，在血液肿瘤中也发现了一些潜在的有希望的靶点，包括白血病表面抗原和CD37。
有效的ADC活性所需的抗原表达水平根据不同抗原特性而变化。ADC需要至少个抗原/细胞，以确保能够递送致死数量的细胞*性药物。理想情况下，ADC的抗体部分所针对的抗原应在肿瘤细胞表面均匀表达且拷贝数较高（/细胞）。肿瘤细胞表面通常只有有限数量的抗原（大约到个抗原/细胞），当前临床阶段得大多数ADC的平均DAR为3.5-4，因此ADC输送到肿瘤细胞的药物量很低。如上所述，这也被认为是使用传统细胞*性药物（如甲氨蝶呤、紫杉醇类和蒽环类药物）的ADC临床失败的主要原因之一。除了特异性和足够的表达量外，最佳靶抗原还应该诱导有效的ADC内化。与靶细胞表面抗原结合的抗体可触发抗体-抗原复合物进入细胞，从而实现*素药物的细胞内传递。
综上所述，理想的肿瘤抗原需要在癌细胞中高度表达，定位于细胞表面，在ADC结合后有效内化，并在细胞内能够释放细胞*药物。
3.2抗体选择
ADC药物所需抗体分子的基本要求是优先结合靶细胞上的抗原，从而将细胞*药物浓缩在肿瘤部位。抗体应该以高亲合力选择性地与肿瘤细胞结合，并且与正常细胞几乎没有交叉反应。缺乏肿瘤特异性的抗体，因免疫原性从血液循环中清除后，除了对正常细胞有*外，还会导致次选的靶标的暴露和治疗效果的降低。因此，细胞*性药物通常与单克隆抗体的Fc部分连接，以免干扰抗原的结合和检测时产生干扰。
所有目前处于临床试验中的ADC都使用了人IgG分子，因为这些分子量达kDa的生物分子不仅含有多个天然位点用于偶联，而且还可以通过修饰产生其他偶联位点。一般而言，IgG分子因其对靶点抗原的高亲合力和血液中长循环半衰期，导致肿瘤部位的累积增加。然而，与单克隆抗体类似，大多数ADC选择IgG1，原因如下：①不同的IgG亚型有不同的Fc免疫功能，包括抗体依赖性细胞介导的细胞*性（ADCC）和补体依赖性细胞*性（CDC）。与IgG4和IgG2亚型相比，人IgG1和IgG3有更强的ADCC和CDC。人IgG4还具有抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）。然而，一些研究人员认为在细胞*性药物上存在ADCC活性可能会导致*性太大。值得注意的是，在已批准的ADC中，免疫效应功能与否与其体内抗肿瘤活性密切相关。例如，基于IgG1亚型的BrentuximabVedotin，比基于IgG4亚型的GemtuzumabOzogamicin显示出更好的活性。②尽管在肿瘤细胞裂解方面有效，但与IgG1,2和4相比，IgG3抗体的短半衰期和快清除率使它们不能成为用于ADC的选择。③另一方面，IgG4抗体也不是优选的，因为IgG4会发生Fab臂交换，可能形成新的杂合IgG4。为了克服这一点，可以用IgG1的CH3区替换IgG4的CH3区。④IgG2因含有四个链间二硫键（IgG1和IgG4仅有两个）提供了结合更多细胞*素的理论可能性，但IgG2和IgG4铰链比IgG1更难还原，因此，基于半胱氨酸的ADC更难以产生；同时，IgG2具有独特的二硫键异构结构和更复杂的铰链区。所以，IgG1被更多的选择用于ADC的开发。
大多数ADC开发依赖于抗体的内化作用。通过免疫荧光显微镜分析发现，ADC和裸抗之间的内化效率是可以发生变化的，从而影响了药物在肿瘤和正常细胞中的摄取及释放。在某些情况下，二者都以相同的速率内化，而在其他情况下，ADC有更高内化效率。虽然对ADC的作用机制来讲，内化是必要的，但定位于细胞外环境的ADC也可以在靠近肿瘤细胞的位置释放药物。实际上，ADC内化可能不是有效ADC的绝对要求，如CD20，CD21和CD72等非内化抗原，含有不稳定连接子的ADC药物能有效治疗，而含稳定连接子的则无有效治疗作用。实际上，药物在肿瘤细胞外环境中的局部释放可能足以对癌细胞造成损害，但局部药物释放取决于ADC在肿瘤部位的停留时间和连接子的性质。
ADC的免疫原性是其循环半衰期的主要决定因素之一。早期的ADC利用鼠源单克隆抗体诱发人类强烈的免疫反应，导致单剂量2周内HAMAs迅速形成。从那时起，鼠源单克隆抗体逐步被嵌合，人源化或全人源单克隆抗体取代。目前在临床开发中的大多数ADC均使用人源化或全人源抗体，而针对被识别为半抗原的细胞*性药物的抗体的形成较为少见。
综上所述，用于ADC开发的理想单克隆抗体应该是人源化或全人源单克隆抗体分子，其能够选择性地结合肿瘤细胞而与对正常细胞没有交叉反应。此外，ADC内化可能是成功治疗的重要因素，但不是绝对因素。
3.3细胞*性有效荷载选择
细胞*性药物（小分子，有效荷载或弹头）是影响ADC活性和特征的关键因素。用于ADC开发的细胞*性药物必须满足以下几点，很强的细胞*性，在肿瘤细胞中释放原始药物的适当修饰位点，偶联后保持活性，可接受的水溶性，水性制剂和生理条件下的稳定性，以及明确的作用机制。此外，药物应在良好生产规范（GMP）的条件下合成获得，并且成本可控。大多数细胞*性药物是疏水性的，并且倾向于诱导抗体产生聚集。所以，为保证较长的保质期，并限制快速清除率和免疫原性，应